È noto soprattutto per aver interpretato Paul nella serie TV Dexter. Ha inoltre collezionato apparizioni in diverse serie televisive come ER, X-Files, ' e NYPD Blue e in alcuni film tra i quali ', Il grande Lebowski e Il mistero dei templari. È insegnante alla Playhouse West a North Hollywood ed è anche veterano dell'esercito statunitense. Nel 2009 è apparso come personaggio principale nel finale della quinta stagione di Lost dando finalmente un volto al misterioso Jacob e nel giugno dello stesso anno è stata reso noto che Mark Pellegrino è stato scritturato per la quinta stagione di Supernatural per interpretare il ruolo di Lucifero, uno dei personaggi principali.
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